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DNA-Methylierungsanalyse

Epigenetische Prozesse steuern die Chromatinkonformation und dadurch die Genexpression, ohne dabei die Nukleotidsequenz der DNA zu verändern. Die DNA-Methylierung ist eine vererbbare epigenetische Prägung, die eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung spielt. Im Allgemeinen ist eine Hypermethylierung der Promotorregion von Genen mit einer Stilllegung („gene silencing“) dieser Gene assoziiert.

Umweltfaktoren, wie z.B. Ernährung, Exposition gegenüber toxischen Substanzen und ein stressiger Lebensstil, können die Expression von Genen durch Änderungen des Methylierungsmusters der DNA verändern. Abnormale DNA-Methylierungsmuster konnten in einer Vielzahl von komplexen Erkrankungen, wie neurodegenerativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen sowie Krebs, nachgewiesen werden. Die Stilllegung von Tumorsuppressorgenen durch eine Hypermethylierung der Promotorregion gilt als eines der frühesten Ereignisse während der Kanzerogenese.

Unsere Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung und Validierung von Analysenmethoden, mit denen der Status der DNA-Methylierung in der Promotorregion von Kandidatengenen bestimmt werden kann. Die Methoden basieren auf der methylierungs-sensitiven hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse bzw. der Pyrosequenzierung.

Die Methoden werden auf folgende Themen angewendet:

  • Wir untersuchen, ob sich der Grad der Promotormethylierung von Tumorsuppressorgenen (wie z.B. APC, BRCA1, HIN-1, RASSF1A, GSTP1 und MGMT) im Tumorgewebe von Brustkrebspatientinnen im Vergleich zum angrenzenden und histologisch normalen Brustgewebe unterscheidet. Änderungen im DNA-Methylierungsmuster könnten erklären, warum es selbst im histologisch normalen Gewebe zu einem Wiederauftreten des Tumors kommen kann. (in Zusammenarbeit mit Georg Pfeiler, Medizinische Universität Wien, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie).
  • In Zusammenarbeit mit Bernhard Keppler (Universität Wien, Institut für Anorganische Chemie) und Walter Berger (Medizinische Universität Wien, Institut für Krebsforschung) untersuchen wir, ob Substanzen mit Antitumor-Wirkung den Grad der DNA-Methylierung von Kandidatengenen, wie z.B. ABCB1, in Multidrug-resistenten Krebszellen beeinflussen.
  • Studien haben gezeigt, dass Statine und Bisphosphonate, die häufig zur Senkung des Cholesterinspiegels bzw. zur Behandlung von Osteoporose verschrieben werden, eine Antitumor-Wirkung aufweisen, indem sie die Apoptose, Zellproliferation, Angiogenese und Metastasierung beeinflussen. In Zusammenarbeit mit Franz Varga (Ludwig Boltzmann Institut für Osteologie, Wien) untersuchen wir den Einfluss von Statinen und Bisphosphonaten auf die  DNA-Methylierung von Kandidatengenen, um ihren genauen Wirkmechanismus aufklären zu können.
  • Epigenetische Mechanismen, u.a. die DNA-Methylierung, scheinen essentielle Regulatoren der neuronalen Plastizität zu sein. In Zusammenarbeit mit Gert Lubec (Medizinische Universität Wien, The Gert Lubec Proteomics Laboratory) untersuchen wir, ob räumliches Lernen von Ratten (z. B. im Morris-Wasserlabyrinth) zur Änderung der DNA-Methylierung von Kandidatengenen (z.B. AMPA-Rezeptoren, BDNF und Reelin) im Hippocampus führt.

Analyse von Lebensmittelallergenen

Lebensmittelallergien können in sensibilisierten Personen schwere allergische Reaktionen bis hin zu einer lebensbedrohlichen Anaphylaxie hervorrufen. Die einzige Möglichkeit für Allergiker ist es, den Konsum jener Lebensmittel, auf die sie allergisch reagieren, strikt zu vermeiden. Um diesen Personen die Ernährungsplanung zu erleichtern, müssen in der Europäischen Union 14 allergene Lebensmittel und ihre Verarbeitungsprodukte gemäß der Richtlinie 2007/68/EG deklariert werden.

Unsere Arbeitsgruppe befasst sich mit der Entwicklung und Validierung von Analysenmethoden, die es ermöglichen, die Umsetzung der gesetzlichen Bestimmungen zu kontrollieren. Um anwendbar zu sein, müssen die Analysenmethoden selektiv, empfindlich und sowohl auf rohe als auch auf stark verarbeitete Lebensmittel anwendbar sein. Wir entwickeln und validieren Enzymimmunoassays (ELISA) und PCR-Methoden. Vor kurzem haben wir kompetitive ELISAs und Sandwich ELISAs zur Bestimmung von Sesam und Lupine in Lebensmitteln entwickelt. Zurzeit entwickeln wir eine real-time PCR Methode für potenziell allergenen Mohn. In Zusammenarbeit mit Rupert Hochegger (Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit (AGES), Institut für Lebensmittelsicherheit, Abteilung für Molekularbiologie und Mikrobiologie, Wien) haben wir real-time PCR Assays für Senf und Sellerie entwickelt und validiert. Unser Highlight ist ein Triplex-real-time PCR Assay, der den gleichzeitigen Nachweis von weißem, schwarzem und braunem Senf und Sellerie in ein und demselben PCR-Gefäß ermöglicht.

Authentizitätsbestimmung von Wildfleisch

Lebensmittelhersteller müssen nicht nur die Sicherheit, sondern auch die Authentizität ihrer Lebensmittel gewährleisten. Wildfleisch ist besonders anfällig für Verfälschungen, da es als wertvoller angesehen wird als Fleisch von domestizierten Tieren. Darüber hinaus wird es vor allem wegen seines unverwechselbaren Geschmacks und seines geringen Fett- und Cholesteringehalts geschätzt.

Gemäß dem Codex Alimentarius Austriacus müssen Würste, die als „Wild-Würste“ deklariert sind, einen Mindestanteil von 38% Wildfleisch aufweisen.

Analysenmethoden zum Nachweis von Wildfleisch-Verfälschungen müssen daher nicht nur die Identifizierung der einzelnen Fleischarten, sondern auch deren quantitative Bestimmung in Lebensmitteln ermöglichen. Die Quantifizierung der einzelnen Fleischarten in einem Lebensmittel ist jedoch relativ schwierig.

Wir haben vor kurzem in Zusammenarbeit mit Rupert Hochegger (AGES) zwei real-time PCR Methoden entwickelt und validiert, eine Methode zur Quantifizierung von Reh und eine, welche die gleichzeitige Detektion und Quantifizierung einer Verfälschung von Damwild, Rotwild und Sikawild ermöglicht.

Bestimmung von Midazolam und seiner Hauptmetaboliten in biologischen Proben

Midazolam ist ein Beruhigungsmittel, welches routinemäßig bei Patienten angewendet  wird, die auf der Intensivstation betreut werden. Aufgrund seiner pharmakologischen Eigenschaften, d. h. einer Halbwertszeit von ca. drei Stunden und einem minimalen Einfluss auf die Hämodynamik, wird seine Verwendung zur Sedierung auch über längere Zeiträume zugelassen. Bei Patienten mit Nieren- und Leberversagen kann es jedoch zu einer Akkumulation von Midazolam-Metaboliten und in der Folge zu einer nicht gewollten Verlängerung der Sedierung kommen.

In Zusammenarbeit mit Michael Hiesmayr (Medizinische Universität Wien, Abteilung für Anästhesie, Allgemeine Intensivmedizin und Schmerztherapie) entwickeln wir derzeit eine HPLC-Methode, welche die Trennung und Quantifizierung von Midazolam und seinen Metaboliten 1-Hydroxymidazolam, 4-Hydroxymidazolam, 1-Hydroxymidazolam-β-D-Glucuronid und 4-Hydroxymidazolam-β-D-Glucuronid in Serum- und Urinproben ermöglicht. Die HPLC-Methode wird angewandt werden, um die Pharmakokinetik von Midazolam in Patienten mit Nieren- und Leber-Versagen zu untersuchen.

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